在ELISA试剂盒，显色反应的ELISA方法的最后一步，和酶催化有色产物的形成。反应温度和时间仍然是影响显色的因素。在一定的时间内，负孔可以保持无色，而正孔则随着时间的延长而增强。适当提高温度有助于加速显色。在定量测定中，底物加入后的反应温度和时间应尽可能准确。彩色的定性测定可在室温下进行，时间一般不需要严格控制，有时根据阳性对照和阴性对照孔的孔，在适当的情况下缩短或延长反应时间的颜色，及时判断。
反应后不再加深底物颜色一般是在室外温度或37 20-30分钟，然后再延长反应时间，增加背景值。光注自色底物溶液，显色反应应避光，并在年底停止溶液反应显色反应。用硫酸终止门诊的产品，从橙褐黄色的颜色。
TMB不受光线的影响，可以在室温下放置在操作台上，不良反应的观察结果。然而，为了确保实验结果的稳定性，建议在适当的时间读取结果。TMB HRP作用后，约40分钟。然后逐渐减弱，色达峰完全缓解至无色后2小时。有许多种类的TMB终止溶液，如叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）可以抑制反应。这种终止剂仍能保持蓝色的很长一段时间（12-24小时）不褪，是一种很好的终止剂视觉判断。此外，各种酸性终止液会使蓝色变成黄色，此时可以使用一个特定的波长（450nm）测量吸光度值。
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