兔抗平滑肌细胞抗体（ASMA） elisa试剂盒使用说明书 
本试剂盒仅供研究使用 

预期应用 
ELISA法定量测定兔血清、血浆或其它相关液体中抗内皮细胞抗体（ASMA）含量。 
实验原理 
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中ASMA水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入ASMA抗原、生物素化的抗兔ASMA抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ASMA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 
试剂盒组成及试剂配制 
1. 酶联板：一块（96孔） 
标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1000 U/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成1000 U/mL，500 U/mL ，250 U/mL，125 U/mL，62.5 U/mL，31 U/mL，15.6 U/mL，其原液直接作为*标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 U/mL，临用前15分钟内配制。 
如配制500 U/mL标准品：取0.5ml 1000 U/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 
2. 样品稀释液：1×20ml/瓶。 
3. 检测稀释液A：1×10ml/瓶。 
4. 检测稀释液B：1×10ml/瓶。 
5. 检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A 1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 
6. 检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。稀释方法同检测溶液A。 
7. 底物溶液：1×10ml/瓶。 
8. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 
9. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 
标本的采集及保存 
1．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 
2．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 
注：标本溶血会影响*检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 
操作步骤 
各试剂在使用前平衡至室温。 
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120分钟。 
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。 
3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。 
4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。 
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显）。 
6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 
注： 
1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是*加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。 
洗板方法 
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。 
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 
特异性 
本试剂盒可同时检测重组或天然的兔ASMA，且与其它相关蛋白无交叉反应。 
计算 
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 
注意事项 
1． 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 
2． 一次加样时间*控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 
3． 请每次测定的同时做标准曲线，*做复孔。 
4． 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请*乘以稀释倍数。 
5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。 
6．底物请避光保存。 
检测范围： 
15.6 U/mL -1000 U/mL 
说明 
1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。 
2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与*一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。 
3. 试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃，部分试剂保存于2-8℃，具体以标签上的标示为准。 
4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 
5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 
6. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 
7. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 
8. 有效期：6个月