Fluo-4 是一种将 Fluo-3 结构中的 Cl 替换成 F 的钙荧光探针。由于将 Cl 替换成了电子吸引力更 强的 F，它的 激发波长会向短波长处偏离 10 nm 左右。这个波长更接近于氩激光器的波长，所 以用氩激光器激发时，Fluo-4 的荧光强度比 Fluo-3 强一倍。 Fluo-4, AM 穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-4，从而被滞留在细胞内， Fluo-4 若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强 的荧光， 激发波长为 494nm， 发射波长为 516nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞 仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 

使用方法（仅供参考）： 

1. 用 HBSS 稀释 Fluo-4, AM 溶液，制备 4-5μM 的 Fluo-4, AM 工作液。

2. 将 Fluo-4, AM 工作液加入细胞，在 37℃培养 20 分钟。

3. 加入 5 倍体积的含有 1%胎牛血清的 HBSS，再继续培养 40 分钟。

4. 用 HEPES buffer saline 洗涤细胞 3 次，然后用 HEPES buffer saline 使细胞重悬浮，制成 1×105 cells/mL 的溶液。

5. 37℃下培养 10 分钟，然后用该细胞进行荧光钙离子检测。激发波长 506nm，发射波长 526nm。

   *标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定 条件。以上方法仅供参考。

   
   

   
   

   注意事项： 1、 如果使用含有血清的培养基，血清中的脂酶会分解 AM 体，从而降低 Fluo-4, AM 进入细胞的效 果。

                     2、含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前，应该尽量去除培养基 残留。

                     3、Pluronic F127 可以防止 Fluo-4,AM 在 HBSS 中聚合并能够帮助其进入细胞。可以向 Fluo-4,AM溶液中加入适量 Pluronic F127 溶液， 但不建议在 Pluronic F127 中长期保存 Fluo-4,AM 溶液。 

                     4、荧光染料均存在萃灭问题，请注意避光，以减缓荧光萃灭。